БИОТЕХНОЛОГИЯ

В настоящее время клонировано много генов, кодирующих важные для науки и практики белки. После переноса таких генов в клетки животных можно получать клетки - продуценты биологически активных белков. Белки, синтезируемые клетками животных, всегда полноценны, поскольку они правильно формируются и претерпевают все необходимые модификации (гликозилирование, карбоксилирование, гидроксилирование).

В наши дни в промышленных масштабах в биореакторах с помощью клеток животных налажено производство большого числа биологически активных белков которые используют как медицинские препараты. Наибольший интерес представляют эритропоэтин, активатора плазминогена, фактор свертывания крови антитрипсин, поверхностный белок вируса гепатита в интерлейкины, различные моноклональные антитела, антигены вируса СПИД.

Коротко о важнейших из них. Эритропоэтин гормон стимулирующий образование красных кровяных телец. Его используют при анемиях, обусловленных почечной недостаточностью (эритропоэтин синтезируется в почках). Факторы свертываемости крови VIII и IX используют яри лечении наследственной гемофилии для остановки кровотечений, активатор плазминогена, напротив, для предотвращения образования тромбов. Гормон роста - препарат для лечения карликовости, инсулин - для лечения диабета, гонадотропные гормоны (фолликулостимулирующий, лютеинизирующий, хорионический) - для нормализации или стимуляции функций яичника, антитрипсин - для лечения эмфиземы.

Быстро расширяется сфера биотехнологии, основанная на иммунологии, - иммунобиотехнология. Сюда относится индустрия диагностических тест-систем (диагностикумов) для широкого обследования распространенности инфекций, изготовление вакцин и, конечно, получение поликлональных и моноклональных антител. Все наслышаны о таких белках, как лимфокины, к которым относятся интерфероны, интерлейкины, фактор, стимулирующий колониеобразованне гранулоцитов и макрофагов, фактор некроза опухолей и некоторые другие. Эти белки секретируются клетками иммунной системы в ответ на появление внешнего антигена. Их используют в качестве противовирусных и противоопухолевых препаратов (возможность лечения ими злокачественных новообразований пока проблематична). Производство некоторых лимфокинов отлажено и в бактериальной системе, о чем мы уже говорили, но иногда клетки животных более приемлемы для этой цели, особенно для тех белков, которые содержат углеводный центр. Несколько подробнее остановимся на производстве антител. С давних пор для их получения используются животные - кролики, козы, бараны. На появление в крови чужеродного белка-антигена иммунная система реагирует активацией размножения В-лимфоцитов, в которых начинается синтез антител. На поверхности антигена обычно содержится несколько “активных” участков (антигенных детерминант), каждый из которых побуждает образование антител против себя. При этом к каждая В-клетка и ее потомки специализируются на синтезе одного сорта антител. В результате образуется столько разных видов антителообразующих В-клеток, сколько в антигене имеется детерминант. Получаемая при этом из крови антисыворотка содержит смесь антител к разным детерминантам. Такие антитела называют полиспецифическими, чаще - поликлональными.

Природные микроорганизмы, как правило, обладают низкой продуктивностью тех веществ, производство которых необходимо. Для биотехнологии нужны высокопродуктивные штаммы микроорганизмов. Их создают методами селекции - направленного отбора спонтанных или индуцированных (химическими мутагенами или радиацией) мутантов. Получение таких штаммов занимаются иногда многие годы. В результате селекции производительность продуцентов удается увеличить в сотни или тысячи раз. Например, в работе с Penicillium методами селекции выход пенициллина был увеличен в конце концов, примерно в 10 тыс. раз по сравнению с исходным диким штаммом.

Отбору высокопроизводительных штаммов предшествуют тонкие манипуляции селекционера с генетическим материалом исходных штаммов. При этом используют весь спектр естественных способов рекомбинирования генов, известных у бактерий: конъюгацию, трансдукцию, трансформацию и другие генетические процессы. Например, конъюгация (обмен генетическим материалом между бактериями) была успешно использована при создании штамма Pseudomonas putida, способного утилизовать углеводороды нефти. Очень часто прибегают к трансдукции (перенос гена из одной бактерии в другую посредством бактериальных вирусов - бактериофагов) и амплификации (увеличение числа копий нужного гена).

Так, у многих микроорганизмов гены биосинтеза антибиотиков или их регуляторы находятся не в основной хромосоме, а в плазмидах. Путем амплификации удается увеличить число этих плазмид в клетках и существенно повысить производство антибиотиков.

Еще один подход в генетико-селекционной работе - получение генетических рекомбинантов путем слияния разных штаммов бактерий, лишенных стенок (протопластов). Так, слиянием протопластов двух штаммов Streptomyces был сконструирован новый высокоэффективный штамм-продуцент рифампицина С: мутанты Nocardia mediterranei, в которых не синтезировался рифампицин, после слияния сформировали штаммы, продуцирующие три новых рифампицина. Слияние протопластов позволяет объединять генетические материалы и таких микроорганизмов, которые в естественных условиях не скрещиваются.

Ожидается, что прикладная энзимология затронет также область промышленной модификации сахаров и спиртов, эстерификацию олигосахаридов и рибофлавина (витамина В2) и др. Для повышения выхода конечного продукта, упрощения ферментативных процессов и повышения их производственной эффективности в нынешние технологии получения и использования ферментов внедряют генно-инженерные методы. Хороший пример - сыроварение, в котором одновременно используют молочнокислые бактерии и фермент химозин из желудка телят. Клонированный ген прохимозина коровы был перенесен в молочнокислые бактерии Lactococcus и Leuconosloc. Трансформированные молочнокислые бактерии приобрели способность продуцировать химозин что упростило технологию производства сыра. Генно-инженерный (рекомбинатный) пепсиноген, предшественник желудочного фермента пепсина свиньи, получают в клетках Bacillus brevis, трансформированных плазмидой, содержащей ген пепсиногена.

Для повышения термостабильности ферментов в последние годы с помощью генно-инженерных подходов клонируют соответствующие гены из термофильных бактерий и переносят их в клетки продуцентов. Так, для получения из крахмала высокоочищенной глюкозы используют термостабильную а-амилазу Bacillus, продуцируемую Е. coli.

Биотехнологические процессы, состоящие из нескольких ферментативных актов, удается упростить благодаря включению в хромосому одной бактерии всех генов, кодирующих эти ферменты. Таким способом уже удалось в одном ферментационном чане превращать крахмал в фруктозную патоку, ранее для этого процесса требовалось 3 разных фермента - А-амилаза, глюкоамилаза и глюкоизомераза. Для модификации активных центров ферментов и усиления их каталитической активности специалисты возлагают большие надежды на разрабатываемые методы белковой инженерии.

Все, о чем мы рассказываем, - еще не полностью готовые производственные биотехнологии, а лишь подготовка базы для их создания. Существует два тесно взаимосвязанных варианта будущего биотехнологического производства ценных продуктов из растений; культивирование целых растений и культивирование клеток.

Методы культивирования растительных клеток в питательных средах создали самостоятельную отрасль биотехнологического производства ценных препаратов. Если культуру получать из одной клетки, то все вновь выросшие клетки будут генетически идентичны и образуют клон. Такие клоны интенсивно размножающихся клеток, как и бактериальные культуры, - хорошие продуценты ценных растительных продуктов. Их производительность и экономичность зачастую значительно выше, чем у целых растений. Здесь, как и при работе с бактериями, можно использовать клетки, которые в растениях производят нужный продукт, а можно целенаправленно изменить клетку с помощью методов генной инженерии, сделав ее ценным продуцентом необходимого продукта. В производстве уже используются клеточные культуры следующих природных продуцентов: клетки табака, производящие убихинон-10 (применяют как витамин), культуру клеток барбариса, продуцирующую ятрорризин (спазмолитическое лекарственное средство), клетки воробейника, производящие шиконин (используются при лечении ран, ожогов, геморроя). Однако промышленное производство этих культур, за исключением, например, продуцентов шиконина, пока экономически невыгодно. Требуется дальнейшее усовершенствование технологии культивирования клеток и повышение их продуктивности.

Несомненно, что область клеточных биотехнологий в ближайшем будущем, после того как реализует свои возможности генная инженерия, станет важнейшим источником ценных продуктов. Сначала будут получены трансгенные растения, а затем из них - высокопродуктивные культуры клеток. Например, трансгенные растения рапса, в которые введены гены лей-энкефалина и других нейропептидов человека, соединенные с частью гена альбумина , продуцируют около 1 мг ценного рекомбинантного белка на 1 т семян.