На основе рекомбинантного вируса коровьей оспы, несущего ген гликопротеида вируса бешенства, создано новое поколение вакцин против бешенства.
Суть метода генно-инженерного получения живых вакцин отражена далее. В рекомбинантную молекулу ДНК с геном тимидинкиназы (ТК) вируса вакцины оставляют ген другого вируса (герпеса, гепатита, вазикулярного стоматита или др.). Нормальный вирус вакцины и составную плазмиду переносят в клетки животных, в которых собственный ген. тимидинкиназы не работает (ТК-клетки). Ввиду наличия гомологии (схожести) между вирусной и плазмидной ДНК (общее у них - тимидинкиназный ген) между ними происходит гомологичная рекомбинация. Клетки, в которых такая рекомбинация не произошла, становятся ТК (за счет работы тимидинкиназного гена вируса вакцины), а клетки с рекомбинантным вирусом остаются ТК, что и позволяет их отселектировать (разделить). Такие составные вирусы используют затем в качестве живых безопасных вакцин. Вставляя в вирус вакцины одновременно гены разных вирусом, можно создавать мультивалентную вакцину против нескольких вирусов одновременно.
Получение биологически активных белков с помощью культивируемых клеток животных проводится в промышленных масштабах с использованием ферментеров - специальных культиваторов, в которых можно выращивать клетки в больших количествах. Самый крупный ферментер для культивирования животных клеток-продуцентов создан фирмой Cellthech. Его объем 2000 л, а производительность - 15 кг МАТ в год. Существует проект ферментера на 10 000 л.
Потребность в продуктах, синтезируемых клетками животных, непрерывно растет. В 1990 г. рынок сбыта (потребность) одного из таких продуктов - эритропоэтина - оценен в 400 - 750 млн. долл. В 1987 г. в США было продано рекомбинантных вакцин на сумму 745 млн. долл. Ожидается, что в 1993 г. эта сумма возрастет до 4,5 млрд. долл. Для диагиостикумов иммунных заболеваний (главным образом СПИДа), создаваемых на основе антител, только в США рынок сбыта составлял в 1987 т. 167,2 млн. долл., а к 1992 г. он достигнет, как ожидается, 294 млн. долл.
Природные микроорганизмы, как правило, обладают низкой продуктивностью тех веществ, производство которых необходимо. Для биотехнологии нужны высокопродуктивные штаммы микроорганизмов. Их создают методами селекции - направленного отбора спонтанных или индуцированных (химическими мутагенами или радиацией) мутантов. Получение таких штаммов занимаются иногда многие годы. В результате селекции производительность продуцентов удается увеличить в сотни или тысячи раз. Например, в работе с Penicillium методами селекции выход пенициллина был увеличен в конце концов, примерно в 10 тыс. раз по сравнению с исходным диким штаммом.
Отбору высокопроизводительных штаммов предшествуют тонкие манипуляции селекционера с генетическим материалом исходных штаммов. При этом используют весь спектр естественных способов рекомбинирования генов, известных у бактерий: конъюгацию, трансдукцию, трансформацию и другие генетические процессы. Например, конъюгация (обмен генетическим материалом между бактериями) была успешно использована при создании штамма Pseudomonas putida, способного утилизовать углеводороды нефти. Очень часто прибегают к трансдукции (перенос гена из одной бактерии в другую посредством бактериальных вирусов - бактериофагов) и амплификации (увеличение числа копий нужного гена).
Так, у многих микроорганизмов гены биосинтеза антибиотиков или их регуляторы находятся не в основной хромосоме, а в плазмидах. Путем амплификации удается увеличить число этих плазмид в клетках и существенно повысить производство антибиотиков.
Еще один подход в генетико-селекционной работе - получение генетических рекомбинантов путем слияния разных штаммов бактерий, лишенных стенок (протопластов). Так, слиянием протопластов двух штаммов Streptomyces был сконструирован новый высокоэффективный штамм-продуцент рифампицина С: мутанты Nocardia mediterranei, в которых не синтезировался рифампицин, после слияния сформировали штаммы, продуцирующие три новых рифампицина. Слияние протопластов позволяет объединять генетические материалы и таких микроорганизмов, которые в естественных условиях не скрещиваются.
Большое значение для медицины и сельского хозяйства имеют вакцины, которые вызывают активный иммунитет против инфекционных болезней. С помощью генной инженерии получены так называемые рекомбинантные вакцины.
Такой составной вирус экспрессировал слитый белок на поверхности инфицированных им клеток, растущих в культуре. При инъекциях этих клеток в цыплят почти все иммунизированные птицы были устойчивы к вирусу болезни Ньюкасле. Аналогичная живая вакцина была получена и для вируса бронхита птиц.
Отлажена техника изготовления вакцин-антигенов, которая заключается в клонировании и функционировании отдельных генов возбудителей болезней в Е. coli, дрожжах, клетках насекомых или млекопитающих. Вакцины-антигены высокостабильны, малоопасны как аллергены и неинфекционны. Одна из проблем, возникающая при использовании этих вакцин - наблюдающаяся низкая иммуногенность.
Чтобы пациенты легко переносили действие вакцин и для повышения их эффективности разработаны синтетические вакцины. Их создают с помощью соединения фрагментов белков, полисахаридов и других веществ микроорганизмов (к которым образуются антитела) с большими молекулами-носителями (адъювантами), которые усиливают иммуногенность антигенов. При этом к одной молекуле, стимулирующей иммунный ответ, могут быть присоединены фрагменты антигенов нескольких видов микробов и вирусов, что приводит к образованию поливакцин.
С помощью генной инженерии уже получены первые коммерчески доступные вакцины для человека пробактериального энтеротоксина, против гепатита Б.
На начальном этапе своего развития биотехнология в основном пользовалась живыми системами в том виде, в каком они существовали в природе. Следующий шаг - использование традиционных методов селекции (искусственного отбора) микроорганизмов, растений и животных, получение более продуктивных штаммов, линий. В последние 10 - 15 лет целенаправленнее улучшение свойств живых систем как объектов биотехнологии резко ускорилось и расширилось после того, как с середины 70-х до середины 80-х гг. были разработаны методы генной инженерии. Сначала это были методы рекомбинирования и конструирования очищенных из клеток генов. На следующем этапе были усовершенствованы методы переноса генов в микроорганизмы, а в конце 70-х годов отработаны подходы к переносу генов в культивируемые клетки животных.
В 1980 - 1982 гг. появились методы переноса генов в целые (многоклеточные) животные организмы и почти одновременно - методы переноса генов в растительные клетки и в целые растения. Микроорганизмы, а также клетки, растущие вне организма, после переноса в них новых генов называют генетически трансформированными клетками. Трансформированными можно называть и многоклеточные организмы - животные, растения, но чаще их обозначают как трансгенные животные и растения. Генетический материал переносят в клетки и организмы с помощью разных методов. В микроорганизмы гены вводят в составе кольцевых молекул.
Особые приемы используют для переноса генов в целые животные организмы. Один из них заключается в том, что очищенные гены впрыскивают в только что оплодотворившиеся яйцеклетки (зиготы) с помощью шприца и микропипетки, кончик которой (с внутренним диаметром ~1 мкм) вводят непосредственно в ядро. Ген можно перенести в эмбрион и с помощью вирусов. Существует 2 подхода переноса генов в растения. Первый состоит в том, что гены вводят в изолированные клетки, лишенные полисахаридных стенок (такие клетки называют протопластами). Затем из этих клеток получают целые растения. При другом подходе используют ДНК (Ti-плазмиду) микроорганизма Agrobacterium tumefaciens, способного заражать растительные клетки и переносить в них часть Ti-плазмиды вместе с любой содержащейся в ней чужой ДНК. Переносимый ген предварительно вводят в эту часть Ti-плазмиды. Напомним, что плазмиды - кольцевые молекулы ДНК, присутствующие в клетках вне хромосом.
Естественно, что в небольшой по объему заметке невозможно рассказать в полной мере обо всех аспектах современной биотехнологии. Поэтому наша цель - ознакомить интересующихся лишь с основными, наиболее перспективными направлениями биотехнологических работ.
