БИОТЕХНОЛОГИЯ

Ожидается, что прикладная энзимология затронет также область промышленной модификации сахаров и спиртов, эстерификацию олигосахаридов и рибофлавина (витамина В2) и др. Для повышения выхода конечного продукта, упрощения ферментативных процессов и повышения их производственной эффективности в нынешние технологии получения и использования ферментов внедряют генно-инженерные методы. Хороший пример - сыроварение, в котором одновременно используют молочнокислые бактерии и фермент химозин из желудка телят. Клонированный ген прохимозина коровы был перенесен в молочнокислые бактерии Lactococcus и Leuconosloc. Трансформированные молочнокислые бактерии приобрели способность продуцировать химозин что упростило технологию производства сыра. Генно-инженерный (рекомбинатный) пепсиноген, предшественник желудочного фермента пепсина свиньи, получают в клетках Bacillus brevis, трансформированных плазмидой, содержащей ген пепсиногена.

Для повышения термостабильности ферментов в последние годы с помощью генно-инженерных подходов клонируют соответствующие гены из термофильных бактерий и переносят их в клетки продуцентов. Так, для получения из крахмала высокоочищенной глюкозы используют термостабильную а-амилазу Bacillus, продуцируемую Е. coli.

Биотехнологические процессы, состоящие из нескольких ферментативных актов, удается упростить благодаря включению в хромосому одной бактерии всех генов, кодирующих эти ферменты. Таким способом уже удалось в одном ферментационном чане превращать крахмал в фруктозную патоку, ранее для этого процесса требовалось 3 разных фермента - А-амилаза, глюкоамилаза и глюкоизомераза. Для модификации активных центров ферментов и усиления их каталитической активности специалисты возлагают большие надежды на разрабатываемые методы белковой инженерии.

В середине 70-х годов возникла новая экспериментальная технология - генетическая (или генная) инженерия, которая основана на конструировании рекомбинантной ДНК вне клетки (in vitro) и ее размножении в клетках микроорганизмов. В результате использования этой технологии стало возможным выделять индивидуальные гены, модифицировать, соединять друг с другом, получая “слитые гены”, продуцирующие белки с совершенно новыми свойствами (белковая инженерия).

Типичная схема получения и размножения (амплификации) индивидуального фрагмента ДНК (гена) приведена на рис. 2. В качестве векторов, т. е. молекул-носителей, в которых происходит размножение генов, используют плазмиды, бактериофаги и вирусы, способные размножаться в бактериальных клетках. После соединения (лигирования) вектора с фрагментом ДНК, несущим ген, образуется рекомбинантная ДНК. Затем вектор с геном вводят в клетки микроорганизмов (трансформация), где они амплифицируются. В результате получается множество копий одного гена - клон. Поэтому такой способ получения индивидуального гена называют клонированием.

Если для клонирования использовать ДНК человека, содержащую все его гены, они окажутся в разных клонах будет получена генная библиотека (клонотека) человека. Гены животных, человека и растений, клонируемые таким путем в бактериях (как правило, используют Е. coli), не функционируют в них. Для этого их нужно выделить из бактерии, снабдить регулятором бактериального гена и вновь ввести в бактерию. Получены и используются многие штаммы бактерий, в которых функционируют гены разного происхождения, производящие нужные продукты.

Этот арсенал новых, генно-инженерных, штаммов-продуцентов позволил наряду с продуктами природных штаммов (их называют биопродуктами первого поколения) начать производство на базе генно-инженерных штаммов рекомбинантные белки - биопродукцию второго поколения. Биопродукцией третьего поколения будут искусственно синтезированные соединения, полностью имитирующие биологические функции природных белков, но не являющиеся ими.

Генно-инженерные методы (технология рекомбинантных ДНК) все шире используют в биотехнологическом производстве прежде всего ценных для медицины белков, в том числе таких, которые трудно синтезировать химическими методами пли получить в нужных количествах из биологического материала. Это в первую очередь белки и пептиды (белковые молекулы, состоящие из небольшого числа аминокислот), которые синтезируются в организме человека и используются как медикаменты. Усилия генных инженеров направлены на создание бактерий-продуцентов, которые бы с высокой эффективностью производили такие биологически активные продукты. Основные трудности здесь заключаются не столько в конструировании продуцентов, сколько в том, чтобы синтезирующиеся в них чужеродные белки нормально формировались, модифицировались и не разрушались в клетках микроорганизмов.

Перенос генов в растения может быть с успехом использован и для создания новых интересных форм в цветоводстве. С помощью генно-инженерных подходов получена, например, трансгенная петуния с белыми цветами. Достигнуто это путем переноса гена хальконсинтетазы в антисмысловой ориентации. В результате синтеза анти-мРНК нарушалось образование флавиноидов, ключевую роль в котором играет фермент хальконсинтетаза.

Большое внимание в биотехнологических работах уделяют сое, плоды которой содержат много белка (40%) и масла (20%). Некоторым исследовательским группам удалось регенерировать из трансформированных отдельными генами клеток сои, растущих в культуре, целые растения с измененными генетическими свойствами. Они устойчивее к гербицидам, вирусам и насекомым, содержат больше богатых метионином запасных белков. Работы с соей продолжаются с целью получения новых сортов, устойчивых к вирусам и с измененным составом масла. Желание исследователей улучшить свойства такого ценного продукта, как масло, вполне понятно. Ведь мировая продукция растительного масла в настоящее время достигает 60 млн. т, а общая стоимость производимого масла составляет 20 млрд. долл.

Мы уже говорили об ассоциациях растений с микробами. Генная инженерия стремится изменить генетические свойства не только растений, но и ассоциированных с ними микроорганизмов. Известно, что растения получают из почвы лишь незначительную часть содержащегося в ней азота. Некоторых из них снабжают азотом симбиотические бактерии, которые живут в анаэробных условиях в клубеньках, образуемых на корневых волосках. За связывание атмосферного азота у азотфиксирующих клубеньковых бактерий Rhizobium ответственны гены nif. Перенос nif-генов в генетический аппарат растений решил бы важнейшую агробиотехнологическую задачу. Однако сейчас пока удалось реализовать несколько иной подход, который позволяет усилить азотфиксирующие свойства симбионта донника (Rhizobium meliloti) путем увеличения в нем числа nil-генов.

Разработаны подходы для получения морозоустойчивых растений, основанные на генно-инженерных манипуляциях с Pseudomonas syringae, сосуществующей с некоторыми растениями и содержащей белок, который ускоряет кристаллизацию льда. Когда из бактерии удаляют ген для этого белка, полученный штамм называют “лед-минус”. Штамм “лед-минус”, распыленным над клубнями картофеля, конкурирует с обычными бактериями, что в конечном счете приводит к повышению морозоустойчивости растений.

Поскольку растительные клетки окружены жесткими целлюлозными оболочками, для их слияния нужно предварительно растворить эту оболочку, сохранив находящуюся под ней нежную белково-липидную плазматическую мембрану. Клетки, лишенные целлюлозной оболочки, называют протопластами. Получают протопласты обработкой клеток смесью ферментов. Затем протопласты с обнажившейся плазматической мембраной сливают, получая гибридные клетки, несущие свойства обеих клеток-партнеров. Этим путем созданы межвидовые гибриды табака, картофеля, капусты с турнепсом. Протопласты используют та we для переноса в них органоидов других клеток - митохондрий, хлоропластов, цитоплазмы.

Приведем наиболее интересные гибриды, полученные в результате слияния клеток. Широкое распространение в США и Англии получил гибридный сорт помидоров, устойчивый к двум вирусам (PLRV и PVY), которые наносят наибольший вред этим растениям. Гибридный сорт создали в результате слияния протопластов дикого вида помидора S. brevidens, устойчивого к PLRV и PVY, и коммерческого помидора S. tuberosum. В Японии создан таким образом сорт помидора, устойчивого к высоким температурам.

Значительный прогресс в этой области произошел и благодаря искусственным ассоциациям растительных клеток с микроорганизмами, особенно с азотфиксирующими бактериями. Проблема придания растениям свойства азотфиксации имеет огромное народнохозяйственное значение, поскольку производство азотных удобрений требует больших затрат, а их использование загрязняет среду. Уже получены положительные результаты благодаря искусственным ассоциациям азотфиксирующей бактерии Anaboena variabilis и табака. Несколько подробнее о проблеме азотфиксации будет сказано ниже.

Несмотря на очевидные успехи клеточной инженерии, наибольший интерес в последнее время вызывают работы по целенаправленному изменению свойств сельскохозяйственных растений с помощью методов генной инженерии - конструирования и переноса генов в растительные клетки и в целые растения, В последние годы с появлением генно-инженерных методов клонирования генов и их переноса в растительные клетки, а затем и в регенерируемые из них растения стало возможным заметно быстрее создавать новые сорта. Это направление, зародившееся лишь в середине 80-х годов, быстро набирает темп. Изолировано множество генов растений и микроорганизмов, кодирующих признаки продуктивности, устойчивости к неблагоприятным факторам. Получено немало растений, содержащих такие гены. Растения, несущие в геноме чужеродные гены, т. с. трансгенные растения, постепенно внедряются в сельскохозяйственную практику, их вклад в производстве сельскохозяйственной продукции быстро растет. Прогнозируется, что рынок биотехнологически улучшенных растений и семян в США составит в 1992 г. 24 млн., долл., а в 1997 г. может достичь 122,5 млн. долл.