БИОТЕХНОЛОГИЯ

В настоящее время клонировано много генов, кодирующих важные для науки и практики белки. После переноса таких генов в клетки животных можно получать клетки - продуценты биологически активных белков. Белки, синтезируемые клетками животных, всегда полноценны, поскольку они правильно формируются и претерпевают все необходимые модификации (гликозилирование, карбоксилирование, гидроксилирование).

В наши дни в промышленных масштабах в биореакторах с помощью клеток животных налажено производство большого числа биологически активных белков которые используют как медицинские препараты. Наибольший интерес представляют эритропоэтин, активатора плазминогена, фактор свертывания крови антитрипсин, поверхностный белок вируса гепатита в интерлейкины, различные моноклональные антитела, антигены вируса СПИД.

Коротко о важнейших из них. Эритропоэтин гормон стимулирующий образование красных кровяных телец. Его используют при анемиях, обусловленных почечной недостаточностью (эритропоэтин синтезируется в почках). Факторы свертываемости крови VIII и IX используют яри лечении наследственной гемофилии для остановки кровотечений, активатор плазминогена, напротив, для предотвращения образования тромбов. Гормон роста - препарат для лечения карликовости, инсулин - для лечения диабета, гонадотропные гормоны (фолликулостимулирующий, лютеинизирующий, хорионический) - для нормализации или стимуляции функций яичника, антитрипсин - для лечения эмфиземы.

Быстро расширяется сфера биотехнологии, основанная на иммунологии, - иммунобиотехнология. Сюда относится индустрия диагностических тест-систем (диагностикумов) для широкого обследования распространенности инфекций, изготовление вакцин и, конечно, получение поликлональных и моноклональных антител. Все наслышаны о таких белках, как лимфокины, к которым относятся интерфероны, интерлейкины, фактор, стимулирующий колониеобразованне гранулоцитов и макрофагов, фактор некроза опухолей и некоторые другие. Эти белки секретируются клетками иммунной системы в ответ на появление внешнего антигена. Их используют в качестве противовирусных и противоопухолевых препаратов (возможность лечения ими злокачественных новообразований пока проблематична). Производство некоторых лимфокинов отлажено и в бактериальной системе, о чем мы уже говорили, но иногда клетки животных более приемлемы для этой цели, особенно для тех белков, которые содержат углеводный центр. Несколько подробнее остановимся на производстве антител. С давних пор для их получения используются животные - кролики, козы, бараны. На появление в крови чужеродного белка-антигена иммунная система реагирует активацией размножения В-лимфоцитов, в которых начинается синтез антител. На поверхности антигена обычно содержится несколько “активных” участков (антигенных детерминант), каждый из которых побуждает образование антител против себя. При этом к каждая В-клетка и ее потомки специализируются на синтезе одного сорта антител. В результате образуется столько разных видов антителообразующих В-клеток, сколько в антигене имеется детерминант. Получаемая при этом из крови антисыворотка содержит смесь антител к разным детерминантам. Такие антитела называют полиспецифическими, чаще - поликлональными.

В последние годы значительные успехи достигнуты в биотехнологических работах, проводимых с использованием клеток животных. Уже длительное время применяют технику гибридизации животных клеток разного происхождения, а также перенос чужеродных генов в культивируемые клетки.

В середине 70-х годов вирусолог Рудольф Ениш (ФРГ) провел первый успешный эксперимент по переносу чужеродного гена в геном целого животного организма (мыши). В качестве переносчика гена (вектора) использовали вирус лейкоза мышей. В дальнейшем были отработаны различные варианты переноса генов в животных (трансгенные животные), включая прямую микроинъекцию в пронуклеус зиготы. Подобные эксперименты оказали решающее воздействие на вовлечение клеток животных в биотехнологию. Существенно то, что только на базе клеток животных можно получать такие важные для медицины биотехнологические продукты, как антитела и вакцины. Использование клеток животных для продуцирования других биологически активных продуктов пока, как правило, экономически менее выгодно, чем на базе микроорганизмов. Однако получить некоторые полноценные белки можно только из клеток животных.

В середине 70-х годов возникла новая экспериментальная технология - генетическая (или генная) инженерия, которая основана на конструировании рекомбинантной ДНК вне клетки (in vitro) и ее размножении в клетках микроорганизмов. В результате использования этой технологии стало возможным выделять индивидуальные гены, модифицировать, соединять друг с другом, получая “слитые гены”, продуцирующие белки с совершенно новыми свойствами (белковая инженерия).

Типичная схема получения и размножения (амплификации) индивидуального фрагмента ДНК (гена) приведена на рис. 2. В качестве векторов, т. е. молекул-носителей, в которых происходит размножение генов, используют плазмиды, бактериофаги и вирусы, способные размножаться в бактериальных клетках. После соединения (лигирования) вектора с фрагментом ДНК, несущим ген, образуется рекомбинантная ДНК. Затем вектор с геном вводят в клетки микроорганизмов (трансформация), где они амплифицируются. В результате получается множество копий одного гена - клон. Поэтому такой способ получения индивидуального гена называют клонированием.

Если для клонирования использовать ДНК человека, содержащую все его гены, они окажутся в разных клонах будет получена генная библиотека (клонотека) человека. Гены животных, человека и растений, клонируемые таким путем в бактериях (как правило, используют Е. coli), не функционируют в них. Для этого их нужно выделить из бактерии, снабдить регулятором бактериального гена и вновь ввести в бактерию. Получены и используются многие штаммы бактерий, в которых функционируют гены разного происхождения, производящие нужные продукты.

Этот арсенал новых, генно-инженерных, штаммов-продуцентов позволил наряду с продуктами природных штаммов (их называют биопродуктами первого поколения) начать производство на базе генно-инженерных штаммов рекомбинантные белки - биопродукцию второго поколения. Биопродукцией третьего поколения будут искусственно синтезированные соединения, полностью имитирующие биологические функции природных белков, но не являющиеся ими.

Генно-инженерные методы (технология рекомбинантных ДНК) все шире используют в биотехнологическом производстве прежде всего ценных для медицины белков, в том числе таких, которые трудно синтезировать химическими методами пли получить в нужных количествах из биологического материала. Это в первую очередь белки и пептиды (белковые молекулы, состоящие из небольшого числа аминокислот), которые синтезируются в организме человека и используются как медикаменты. Усилия генных инженеров направлены на создание бактерий-продуцентов, которые бы с высокой эффективностью производили такие биологически активные продукты. Основные трудности здесь заключаются не столько в конструировании продуцентов, сколько в том, чтобы синтезирующиеся в них чужеродные белки нормально формировались, модифицировались и не разрушались в клетках микроорганизмов.

Это белки-биостимуляторы, активаторы иммунной системы клеток. Кроме того, они обладают антивирусной активностью и препятствуя размножению раковых клеток. Существуют 3 класса интерферонов человека: а, р и у. Уже в конце 70-х гидов были получены первые гибридные ДНК, способные функционировать в бактериальных клетках с образованием р-интерферона человека. Затем аналогичные конструкции были созданы для а- и у интерферонов.

В результате переноса в клетки Е. соi рекомбинантных (гибридных) ДНК с регуляторными элементами бактериального триптофанового или лактозного оперона и интерфероновыми генами получили соответствующие штаммы-продуценты. Для повышения их продуктивности, а также усиления антивирусной активности интерферонов в дальнейшем было проведено несколько дополнительных модификаций рекомбинантной ДНК (в частности, проведена замена некоторых аминокислот), подобраны генотипы клеток-хозяев и условия их культивирования.

Бактериальные штаммы-продуценты всех трех типов интерферонов были получены и в СССР: для а- и у интерферонов - и Институте биоорганической химии АН СССР, а для р-интерферона - во ВНИИГенетики и селекции промышленных микроорганизмов. Кроме Е. coli, для производства интерферонов используют также грамотрицательные бактерии Metfrylomonas, Salmonella, Pseudomonas и др. В частности, на основе штамма Pseudomonas sp. налажено промышленное получение человеческого р-интерферона в СССР. Созданы и дрожжевые продуценты интерферонов, которые имеют некоторые преимущества перед бактериальными: дрожжи используют более дешевые субстраты, не подвержены литическому действию фагов (что постоянно угрожает бактериальным продуцентам) или аутолизису, легко сепарируются, осуществляют правильный процессинг (формирование) преинтерферонов и др.