БИОТЕХНОЛОГИЯ

Ниже мы приводим некоторые, на наш взгляд наиболее интересные примеры, иллюстрирующие возможности современных биотехнологических подходов основанных на генной инженерии. Как уже говорилось, один из методических приемов переноса генов состоит в пользовании патогенной бактерии Agrobacterium tumefaciens, которая содержит Ti-плазмиду, ответственную за индукцию (побуждение) опухолей у двудольных растений. Технология введения чужеродных генов в эту плазмиду и последующее заражение растений агробактерией с измененной Ti-плазмидой на сегодняшний день наиболее хорошо отработана.

Растения - источник пищи и в принципе обеспечивают потребности человека и животных набором тех соединений, которые клетки животных и человека не синтезируют сами. К таким соединениям относятся и так называемые незаменимые аминокислоты, и многие витамины. Вместе с тем основные виды используемых в пищу растений неполноценны, т. е. дефицитны (для животных) по некоторым аминокислотам. В такие растительные корма необходимо добавлять некоторые аминокислоты - лизин, треонин, триптофан. Бобовые дефицитны по метионину и цистеину.

Для сбалансирования растительных кормов налажено специальное крупномасштабное микробиологическое промышленное производство этих аминокислот. Однако решение проблемы нельзя считать окончательным. Считается, что генная инженерия может кардинально упростить решение этой задачи. В настоящее время уже выделены гены запасаемых белков картофеля (пататин), фасоли (фазеолин), гороха (легуин), кукурузы (зеин), которые составляют основу кормов. Многие из этих генов удалось перенести в растения.

Что специалисты ожидают получить от этих манипуляции? Изменить эти гены таким образом, чтобы в кодируемых ими запасных белках увеличилось содержание дефицитных аминокислот. Есть, правда, опасение, что такая модификация структуры белков будет препятствовать их нормальному “складированию” в семенах. Кроме того, эти белки во многих случаях выполняют определенные функции в клетках, которые после модификации могут блокироваться. Другая идея - использовать искусственно (химически) синтезированные гены, кодирующие в большом количестве незаменимые аминокислоты. Такие эксперименты уже проводят о картофелем для повышения в нем содержания ценных аминокислот.

Ферменты (энзимы) - белки, выполняющие функции биокатализаторов многочисленных химических (биохимических) реакций. Поскольку биотехнология основана на промышленном использовании биопроцессов, которые в значительной мере обеспечиваются ферментами, по существу, ни одна биотехнология не обходится без них. Ферментные системы микроорганизмов (бактерий, дрожжей) были первыми в истории человечества орудиями биотехнологий, на которых основано виноделие, пивоварение, переработка молока и т. д. Рассмотрим лишь 2 наиболее показательных примера состояния этих технологий в эпоху генной инженерии.

Пивоварение - старейшая биотехнологическая индустрия, базирующаяся на жизнедеятельности дрожжей, прежде всего Saccharomyces curevisiae, которые за последнее десятилетие стали одним из наиболее широко используемых генно-инженерных объектов, позволяющих создавать множество новых ценных штаммов. Так, исходные штаммы S. cerevisiae не способны переваривать декстрины, составляющие 20% полисахаридов ячменя, тогда как S. diastalicus содержит фермент амило-1,4глюкозидазу, расщепляющую декстрины (но эти дрожжи производят пиво худшего качества). Ген, кодирующий названный фермент, был изолирован из S. diaslaticus, перенесен и S. cerevisiae, и проблема была решена - получаемое с помощью генно-инженерного штамма пиво содержит очень мало сахаров, больше этанола и имеет улучшенные вкусовые качества.

Другая генно-инженерная операция - перенос а дрожжи из нитчатого гриба Aspergillus awamori гена, кодирующего гликоамидазу, которая расщепляет разветвленные высокомолекулярные полисахариды. Однако этот фермент очень устойчив в пиве и со временем все полисахариды превращаются в глюкозу, а пиво по мере хранения становится сладким. Чтобы устранить этот недостаток, ген перед переносом подвергли химической модификации, которая придала ферменту свойство разрушаться после завершения процесса брожения.

Поприщем генной инженерии стала и такая древняя биотехнология, как сыроварение, В технологии получения сыра ключевая роль принадлежит сычужному ферменту химозину, створаживающему молоко в желудке теленка. Потребность в химозине очень велика и далеко не удовлетворяется природным источником. Ген, кодирующий химозин, был проклонирован из геномной библиотеки коров и перенесен в дрожжи, которые после этого стали продуцентами ценного фермента.

Еще одна проблема в сыроварении - экономная утилизация сыворотку содержащей много ценных продуктов, в частности лактозу. Путем переноса в дрожжи генов (5-галактозидазы и лактозной пермеазы из бактерий получен штамм, который способен расти на сыворотке и производить спирт и биомассу, добавляемую к животным кормам.

Уже давно микроорганизмы используют как источник белка для питания человека и животных. Еще в годы первой мировой войны один из основоположников молекулярной биологии Макс Дельбрюк с коллегами в Германии (в 1937 г. переехал в США) разработали первый технологический процесс промышленного культивирования пивных дрожжей для их добавления в супы и колбасы. Белки, продуцируемые бактериями или дрожжами и используемые в пищевых целях, получили название белки одноклеточных организмов (БОО).

На первом этапе в качестве сырья для микроорганизмов использовали в основном углеводороды нефти. Затем интерес был проявлен к другим субстратам, прежде всего к природным газам (метан). Как субстраты для получения БОО из дрожжей используют некоторые промышленные отходы (например, отработанный сульфитный щелок с бумажных комбинатов, молочную сыворотку - побочный продукт сыроварения, мелассу (патока), отходы спиртоводочных заводов). Промышленный продукт получают в виде суммарной биомассы. Разработаны промышленные линии для производства и переработки микроводорослей с целью получения БОО. Объем дрожжевой биомассы, полученной в мире в 1985 г., превысил 1 млн. т. Ожидается, что в 1990 г. этот объем возрастет более чем в 2 раза.

Производство БОО имеет многие преимущества перед производством белка в животноводстве и растениеводстве: 500 кг дрожжей дают за сутки 80 кг белков, а у быка того же веса суточный привес составляет в лучшем случае 500 г белка. Однако БОО используют в основном как корм для скота, и лишь в будущем можно ожидать создания технологий получения БОО, пригодных для питания человека. Перспективно в этом отношении культивирование некоторых грибов (Fusarium), зеленых водорослей (Chlorella), цианобактерий (Spirulina), имеющих адекватные для человека органолептические свойства. В настоящее время уже налажено производство на базе крахмала волокнистой массы Fusarium как источника пищи для человека.

Изменения в генах, осуществленные с помощью генной инженерии, могут модифицировать структуру и улучшать свойства пищевых белков. Наибольший интерес в плане таких манипуляций привлекают к себе 3 белка животных и растений: овальбумин курицы, составляющий большую часть (54%) белка яйца, казеины (главная фракция в молоке) и белки сои (42% в бобах). Например, манипуляции с кодирующей частью гена k-казеина, в результате которых из белка элиминировался фрагмент, расположенный между 9-й и 17-й аминокислотами, а также” цистеин, участвующий в образовании дисульфидной связи, привели к тому, что новый белок как пищевой продукт стал более качественным.

Не может обойтись без ферментов и медицина. Холестериноксидазу используют в диагностике для определения уровня холестерина в сыворотке крови. Продуцируемую грибами супероксиддисмутазу применяют для лечения артритов, болезней сердца и при трансплантации почек. Терапевтическими свойствами обладают белки стрептокиназа из Е. coli, аспарагиназа из Erwinia chrysantherni и др. Ферменты используют для растворения тромбов, удаления из организма токсических веществ, лечения рака, ожогов. Известно около 200 наследственных заболеваний, связанных с дефицитом ферментов или иных белковых факторов. Их лечение возможно путем введения в организм больных чужеродных ферментов замещающих отсутствующие эндогенные. При септических процессах, инфаркте миокарда, эмфиземе легких, панкреатите применяют ингибиторы ферментов протеаз, получаемые из актиномицетов (химостатин, антипаин и др.) и генно-инженерных штаммов эглии или дрожжей.

Перспективны ферменты и для синтеза тонких химических веществ и осуществления многих производственных процессов в пищевой и фармацевтической промышленности. К ним относятся ферменты, помогающие получать высокофруктозныи сироп, способствующие свертыванию молока, гидролизу лактоз и, белков и жиров, участвующие в синтезе полусинтетического пенициллина, аминокислоты L-лизина и др. Широко применяют в промышленности липазы различного происхождения, которые катализируют многие сложные химические процессы. Например, катализируемая липазой очистка пальмового масла используется для производства какосового масла, 30% которого содержится в шоколаде.

Амилазы из бактерии и грибов расщепляют крахмал до низкомолекулярных сахаров - декстринов, глюкозы, мальтозы. Бактериальные протеазы разрушают белки при выделке кожи, сыроварении. Фермент глюкоизомераза из Bacillus sp. помогает превращать глюкозу во фруктозу. В последнее время внимание привлечено к циклодекстринглюкозилтрансферазам (ЦДГТ), необходимым при производстве циклодекстринов - соединении, важных для химической и фармакологической промышленности, для улучшения качества пищи, производства косметики и т. д. В ближайшее пятилетие ожидается семикратное увеличение потребности в циклодекстринах. А разве могут обойтись без ферментов энзиматический синтез и модификация пептидов? Коммерческий интерес проявляют, например, к энзиматическому синтезу дипептида аспартама, - низкокалорийному пищевому сладкому агенту. Химически этот продукт получали путем соединения ангидрида формиласпарагиновой кислоты и метилового эфира L-фенилаланина. Этот процесс протекает неэффективно, и образующийся аспартам загрязнен другими продуктами реакции. Энзиматически же, с помощью термолизина, синтезируется только чистый аспартам, выход которого составляет больше 99%.