В результате этой сложной, но успешно проведенной работы был получен новый сорт помидоров с улучшенными свойствами, а именно - способностью более продолжительное время не размягчаться при хранении. Заметим, что на получение нового сорта традиционными методами требуется 10 и более лет, в этом случае сорт был получен всего за один сезон. Понятно, почему зарубежные фирмы (например, “Монсанта”) финансируют многомиллиардные научные исследования в области генной инженерии. В этой фирме разрабатывают методы переноса из бактерий в растения генов, кодирующих токсины, убивающие насекомых.
Токсический белок, продуцируемый микробом Bacillus Ihmingiensis, убивает личинок насекомых питающихся листьями. Этот токсин выделен в кристаллическом виде. Один из способов его использования - распыление на поверхность растения. Однако более экономичен и удобен перенос гена токсина в растения. В 1987 г. ген токсина, изолированный из бактерий успешно перенесли в геном табака. Его экспрессия привела к тому, что личинки насекомого Manduca secta погибал при скармливании листьев трансгенного растения
Аналогичные работы проводят с хлопчатником для придания ему устойчивости к гусеницам. Получены растения, содержащие тот же ген токсина. Кроме того, создан инсектицидоустойчивый трансгенный хлопчатник. В геном обычного хлопчатника введен ген ингибитора трипсина коровьего гороха, продукт которого подавляет активность протеаз в пищеварительной системе насекомых. Известны многие токсины, продуцируемые микроорганизмами и эффективно убивающие разные виды насекомых. Сейчас исследуют гены этих токсинов с целью создания, например, трансгенного картофеля, устойчивого к колорадскому жуку.
Это белки-биостимуляторы, активаторы иммунной системы клеток. Кроме того, они обладают антивирусной активностью и препятствуя размножению раковых клеток. Существуют 3 класса интерферонов человека: а, р и у. Уже в конце 70-х гидов были получены первые гибридные ДНК, способные функционировать в бактериальных клетках с образованием р-интерферона человека. Затем аналогичные конструкции были созданы для а- и у интерферонов.
В результате переноса в клетки Е. соi рекомбинантных (гибридных) ДНК с регуляторными элементами бактериального триптофанового или лактозного оперона и интерфероновыми генами получили соответствующие штаммы-продуценты. Для повышения их продуктивности, а также усиления антивирусной активности интерферонов в дальнейшем было проведено несколько дополнительных модификаций рекомбинантной ДНК (в частности, проведена замена некоторых аминокислот), подобраны генотипы клеток-хозяев и условия их культивирования.
Бактериальные штаммы-продуценты всех трех типов интерферонов были получены и в СССР: для а- и у интерферонов - и Институте биоорганической химии АН СССР, а для р-интерферона - во ВНИИГенетики и селекции промышленных микроорганизмов. Кроме Е. coli, для производства интерферонов используют также грамотрицательные бактерии Metfrylomonas, Salmonella, Pseudomonas и др. В частности, на основе штамма Pseudomonas sp. налажено промышленное получение человеческого р-интерферона в СССР. Созданы и дрожжевые продуценты интерферонов, которые имеют некоторые преимущества перед бактериальными: дрожжи используют более дешевые субстраты, не подвержены литическому действию фагов (что постоянно угрожает бактериальным продуцентам) или аутолизису, легко сепарируются, осуществляют правильный процессинг (формирование) преинтерферонов и др.
На начальном этапе своего развития биотехнология в основном пользовалась живыми системами в том виде, в каком они существовали в природе. Следующий шаг - использование традиционных методов селекции (искусственного отбора) микроорганизмов, растений и животных, получение более продуктивных штаммов, линий. В последние 10 - 15 лет целенаправленнее улучшение свойств живых систем как объектов биотехнологии резко ускорилось и расширилось после того, как с середины 70-х до середины 80-х гг. были разработаны методы генной инженерии. Сначала это были методы рекомбинирования и конструирования очищенных из клеток генов. На следующем этапе были усовершенствованы методы переноса генов в микроорганизмы, а в конце 70-х годов отработаны подходы к переносу генов в культивируемые клетки животных.
В 1980 - 1982 гг. появились методы переноса генов в целые (многоклеточные) животные организмы и почти одновременно - методы переноса генов в растительные клетки и в целые растения. Микроорганизмы, а также клетки, растущие вне организма, после переноса в них новых генов называют генетически трансформированными клетками. Трансформированными можно называть и многоклеточные организмы - животные, растения, но чаще их обозначают как трансгенные животные и растения. Генетический материал переносят в клетки и организмы с помощью разных методов. В микроорганизмы гены вводят в составе кольцевых молекул.
Особые приемы используют для переноса генов в целые животные организмы. Один из них заключается в том, что очищенные гены впрыскивают в только что оплодотворившиеся яйцеклетки (зиготы) с помощью шприца и микропипетки, кончик которой (с внутренним диаметром ~1 мкм) вводят непосредственно в ядро. Ген можно перенести в эмбрион и с помощью вирусов. Существует 2 подхода переноса генов в растения. Первый состоит в том, что гены вводят в изолированные клетки, лишенные полисахаридных стенок (такие клетки называют протопластами). Затем из этих клеток получают целые растения. При другом подходе используют ДНК (Ti-плазмиду) микроорганизма Agrobacterium tumefaciens, способного заражать растительные клетки и переносить в них часть Ti-плазмиды вместе с любой содержащейся в ней чужой ДНК. Переносимый ген предварительно вводят в эту часть Ti-плазмиды. Напомним, что плазмиды - кольцевые молекулы ДНК, присутствующие в клетках вне хромосом.
Естественно, что в небольшой по объему заметке невозможно рассказать в полной мере обо всех аспектах современной биотехнологии. Поэтому наша цель - ознакомить интересующихся лишь с основными, наиболее перспективными направлениями биотехнологических работ.
Первоначально во многих случаях ферменты использовали в биотехнологическом производстве только в составе живых клеток, которыми нужно уметь управлять так, чтобы мобилизовать содержащиеся в них ферменты на нужные для производства биопроцессы. Сделать это удается не всегда, поэтому биотехнология, основанная на использовании ферментов в составе клеток (и организмов), имеет пределы на пути повышения эффективности. Идеальной была бы система, в которой можно использовать каталитические свойства очищенных ферментов, создав нужные для каждого производства технологические цепочки. В постепенном вытеснении живых (полуоткрытых) систем, каковыми являются клетки и организмы, биохимическими, т. е. полностью открытыми системами, состоящими из изолированных клеточных структур, и заключается тенденция прогресса в биотехнологии. Однако на каждом этапе развития именно уровень научных и методических достижений определяет возможность отказа от клеток и перехода к открытой системе.
Важнейшее достоинство клеток - это хорошо налаженное автоматическое восполнение изнашивающихся структур и постоянное поддержание их в рабочем состоянии. Этого пока не удалось добиться в открытых системах, они неустойчивы и дороги. Поэтому на данном этапе биотехнология выделения и использования ферментов распространяется пока на те случаи, когда ферменты участвуют в производственных процессах, осуществляются относительно простые химические реакции в производственных масштабах - расщепление (гидролиз), сбраживание, обработка и т. д. Ферментам присущи свойства, которые делают возможным их промышленное применение как катализаторов органических синтезов. Они обладают высокой каталитической активностью и в отличие от неорганических катализаторов высокоспецифичны, работают при умеренных рН и температурах (до 50 - 60°С). Неорганические же катализаторы требуют жестких кислотных и температурных условий, разрушительно действующих как на субстрат, так и на продукт реакции.
Активность ферментов поддается регулированию в широких пределах направленным изменением условий среды, ее кислотности, добавками веществ”, активирующих или подавляющих фермент. Главный недостаток ферментов - “ранимость”, повреждаемость. Правда, достигнуты значительные успехи в изменении свойств ферментов - повышена их устойчивость. Удалось существенно расширить сферу потенциального применения ферментов - они теперь “работают” в ангидридных органических растворителях и суперкритических жидкостях.
